微生物的分離是指將目標菌種從微生物群體（尤其是不同微生物群體）中分離出來的技術，是微生物實驗基礎，也是嘉興無菌檢驗員培訓學員必須要掌握的內容。微生物的分離培養(yǎng)方法主要有三種：劃線分離法，涂布平板法和傾注平板法。本文先為大家說說涂布平板法。
嘉興無菌檢驗員培訓之涂布平板法
1.定義：
待分離微生物樣品經過一系列梯度（一般10倍遞增）稀釋后，使微生物菌體充分分散，成為單細胞，然后再取出一定量，涂布到固體培養(yǎng)基表面的方法，再經過適宜的培養(yǎng)條件，形成單菌落的過程。
2.目的：
(1)獲得純培養(yǎng)物-目標菌。
(2)獲得純培養(yǎng)在微生物雜菌中的數(shù)量或比例—平板計數(shù)。
3.梯度稀釋步驟：
(1)稱量：準確稱取待測樣品1g或量取待測樣品1mL。
(2)稀釋：將上述樣品放入裝有99mL無菌生理鹽水（有小玻璃珠）的250mL三角瓶中，記錄。
(3)搖勻：將上述三角瓶放置于搖床上振蕩30min，使微生物細胞充分分散，靜置20-30s，即成10-2稀釋液。
(4)繼續(xù)稀釋：再用1mL無菌移液器，吸取上述稀釋液1mL，移入裝有9mL無菌水的試管中，吹吸3次，讓菌液和水混合均勻，即成10-3稀釋液。
(5)繼續(xù)稀釋：再換一支無菌移液器，吸取10-3稀釋液1mL，移入裝有9mL無菌水的試管中，吹吸3次，即成10-4稀釋液。
(6)繼續(xù)稀釋：以此類推，連續(xù)梯度稀釋，制成10-7、10-8、10-9 等一系列稀釋菌液。
4.涂布平板步驟：
(1)標記：將事先制備好的無菌平板上標記10-7、10-8、10-9，每一個梯度稀釋設置三個重復。
(2)涂布：用無菌移液器分別吸取10-7稀釋液0.1mL放入編號10-7的3個平板中，然后用涂布棒或涂布器將菌液在平板上涂抹均勻，每個稀釋度用一個涂布器，用完涂布器酒精燈灼燒滅菌。
(3)繼續(xù)涂布：同樣涂布10-8稀釋液和10-9稀釋液，切記更換涂布棒。
(4)培養(yǎng)：將涂布好的平板平放于超凈臺上靜置10min，使菌液滲透入培養(yǎng)基內，然后將平板放置于恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。
(5)計數(shù)：至長出菌落后即可計數(shù)。
(6)保存：將單菌落平板儲存至4℃保存。
5.計數(shù)原則：
(1)計數(shù)原則，平板上菌落數(shù)30-300個為合格。
(2)如果只有一個稀釋度的平均菌落數(shù)，則以該稀釋度平均菌落數(shù)除以涂布平板所用稀釋液體積(0.1mL)，乘以稀釋倍數(shù)作為該樣品的細菌總數(shù)。
(3)如果有兩個稀釋度的平均菌落數(shù)符合要求，則按照兩者菌落總數(shù)之比來決定，如果小于2，取兩者的平均值如果大于2，取較小的菌落總數(shù)。
6.操作技巧：
(1)前幾個稀釋梯度，尤其是第一個梯度適當放大稀釋倍數(shù)。
這樣不容易丟失目標菌，也可以很好地對樣品進行溶解。
(2)學會使用玻璃珠。
玻璃珠的作用是研磨，尤其是粉末或顆粒性樣品，可以將顆粒表面微生物與液體充分接觸。
(3)勤換槍頭或移液管。
這樣不容易造成不同稀釋度間混亂，防止不同梯度間取樣不準。
(4)一定要搖勻。
平板涂布法的難點就在于稀釋，稀釋不準確后面一切都化為零，一定要搖勻再取樣。
(5)利用顯微鏡粗略估測稀釋倍數(shù)。
并不是每一個樣品都需要稀釋到10-9，而是要根據(jù)樣品中微生物的數(shù)量進行稀釋。
(6)涂布完成后，靜置10min再倒置培養(yǎng)。
靜置有利于微生物在培養(yǎng)基表面吸附，直接倒置培養(yǎng)，可能倒置菌液向一側流動。
(7)倒固體培養(yǎng)基的時候，可以適當吹干或提前一到兩天倒平板。
平板表面沒有多余水分且比較濕潤，涂布時候既容易涂開也不會造成出現(xiàn)菌苔。
7.注意事項：
(1)注意涂布力度，大小適宜，不應劃破培養(yǎng)基的表面。
(2)如果發(fā)現(xiàn)平板上水太多，處理后再使用。
(3)切記寫清楚標記。
(4)試驗完畢，注意灼燒涂布器，以免影響環(huán)境，造成交叉污染。
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